Межвидовая конкуренция в биопленках полости рта, опосредованная внеклеточной дезоксирибонуклеазой SsnA Streptococcus gordonii

npj Биопленки и микробиомы, том 8, Номер статьи: 96 (2022) Цитировать эту статью

1299 доступов

9 Альтметрика

Подробности о метриках

Внеклеточная ДНК (эДНК) является ключевым компонентом многих микробных биопленок, включая зубной налет. Однако роль ферментов внеклеточной дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) в биопленках плохо изучена. Streptococcus gordonii — пионер колонизации зубного налета. Здесь мы идентифицировали и охарактеризовали SsnA, белок, связанный с клеточной стенкой, ответственный за внеклеточную ДНКазную активность S. gordonii. SsnA-опосредованная внеклеточная ДНКазная активность S. gordonii подавлялась после роста сахаров. SsnA был очищен как рекомбинантный белок, и было показано, что он неактивен при pH ниже 6,5. SsnA ингибировал образование биопленок Streptococcus mutans в зависимости от pH. Кроме того, SsnA ингибировал рост биопленок микрокосма полости рта в слюне человека. Однако ингибирование улучшалось добавлением сахарозы. В совокупности эти данные указывают на то, что SsnA S. gordonii играет ключевую роль в межвидовой конкуренции внутри биопленок полости рта. Подкисление среды за счет катаболизма сахара может быть стратегией для кариесогенных видов, таких как S. mutans, для предотвращения SsnA-опосредованного исключения из биопленок.

В полости рта обычно обитает от 100 до 300 различных таксонов бактерий, которые колонизируют поверхности твердых и мягких тканей1. Таксономический состав и распределение бактерий в биопленках полости рта определяются процессами избирательного присоединения, конкурентными и мутуалистическими взаимодействиями между видами и окружающей средой, обеспечиваемыми хозяином2,3,4,5. Накопление зубного налета, биопленки, образующейся на поверхности зубов, происходит пространственно-временно упорядоченным образом6. Колонизаторы-первопроходцы, способные прикрепляться к приобретенной эмалевой пленке, закладывают основу зубного налета и обеспечивают рецепторы для рекрутирования вторичных колонизаторов, что в конечном итоге приводит к развитию сложных и динамичных микробных сообществ7,8. Колонизаторы-первопроходцы обычно считаются комменсалами или даже полезными для поддержания здоровья полости рта2,9,10. Однако, если не контролировать зубной налет должным образом, может развиться кариес или пародонтит11. Эти два состояния являются причиной подавляющего большинства случаев потери зубов во всем мире12. Заболевание связано с изменениями в составе и биохимической активности зубного налета, которые приводят к состоянию дисбактериоза13,14. В случае кариеса зубов избыточная частота и/или количество потребляемых с пищей сахаров приводит к образованию дисбиотических биопленок, обогащенных кислыми и ацидогенными бактериями, которые снижают pH на поверхности зубов и вызывают деминерализацию зубной эмали или цемента. Дальнейшее прогрессирование поражения приводит к разрушению дентина и проникновению бактерий в пульповую камеру15,16.

Колонизаторы-первопроходцы, такие как стрептококки группы Mitis, играют важную роль в контроле чрезмерного роста более ацидогенных и кариесогенных бактерий, таких как Streptococcus mutans. Например, Streptococcus gordonii экспрессирует систему аргининдезаминазы (АД), которая противодействует закислению биопленки, генерируя аммиак и углекислый газ, одновременно производя энергию для клеток9,17,18,19,20. В присутствии кислорода S. gordonii и другие стрептококки группы Mitis, включая Streptococcus sanguinis, производят значительные (миллимолярные) количества перекиси водорода (H2O2), которая может ингибировать рост S. mutans21. Кроме того, возможно, что пионеры-колонизаторы конкурируют с S. mutans за места связывания внутри биопленки. Прикрепление S. mutans в значительной степени зависит от присутствия сахарозы, которая метаболизируется внеклеточно с образованием глюканов, которые поддерживают адгезию и колонизацию биопленок22. В отсутствие сахарозы адгезия S. mutans, по-видимому, опосредуется внеклеточной ДНК (эДНК)23. Внеклеточная ДНК также важна для структурной целостности зрелых биопленок S. mutans, поскольку обработка ДНКазой I приводит к дисперсии биопленок24,25. Недавно было показано, что эДНК присутствует в более сложных биопленках, включая смешанные зубные бляшки26,27,28,29,30,31. Лечение зубных бляшек, особенно на ранних стадиях развития, экзогенными ферментами ДНКазами значительно снижает биомассу биопленки и избирательно уничтожает определенные виды, которые, по-видимому, особенно зависят от эДНК27,31,32. Кроме того, эДНК служит источником питательных веществ и резервуаром для горизонтального переноса генов внутри зубного налета3,16.

10 kbp) was observed in extracts isolated from S. mutans biofilms but not in S. gordonii biofilms (Fig. 1a). The size of the fragment was similar to intracellular chromosomal DNA (iDNA) extracted from S. mutans cells. This band was not observed following enzymatic treatment of the extracts with DNase I (Supplementary Fig. 1). NanoDrop spectrophotometry analysis of the extracts showed eDNA represented approximately 19% of the total DNA (iDNA + eDNA) in S. mutans biofilms while it accounted for only 6% of the total DNA in S. gordonii biofilms. The role of eDNA in maintaining the integrity of S. mutans and S. gordonii biofilms was investigated by treating pre-formed S. mutans and S. gordonii biofilms with 5 µg/mL DNase I for 1 h at 37 °C (Fig. 1b, c). Crystal violet staining revealed that DNase I treatment significantly reduced S. mutans biofilm biomass by >90%. By contrast, S. gordonii biofilms were not affected by DNase I treatment. Inclusion of DNase I during biofilm development significantly inhibited the accumulation of S. mutans biofilms but did not affect S. gordonii (Fig. 1d)./p>30-fold after 25 h (Fig. 3c)./p>50% in the presence of glucose, maltose, galactose, fructose or inulin. Streptococci produce acid from sugars and it was possible that the DNase enzyme activity may have been affected by the pH of the cultures. The pH of supernatants from stationary phase S. gordonii BHY cultures was approximately 5.6, whereas the pH of cultures grown with galactose was approximately 4.6 (Fig. 4b). The pH was further reduced to between 4 and 4.2 in cultures grown with glucose, maltose, fructose or inulin. To assess the impact of low pH on DNase activity, BHY was amended to pH 5.5 by the addition of HCl and used to culture S. gordonii cells to stationary phase. The final pH following growth was approximately 4.2 and almost no DNase activity was detected in cells grown in acidified BHY (Fig. 4)./p>1.28 mM MnCl2)./p>64 μM Mn2+ or >40 μM Zn2+. Low concentrations (40 μM) of the chelating agent EDTA were included in these experiments to remove trace metals associated with the enzyme or DNA substrate. It is possible that Zn2+ displaced Mg2+ or Ca2+ from the EDTA, indirectly activating the enzyme. At higher concentrations, Zn2+ in particular appears to be a potent inhibitor of SsnA. This is consistent with other DNase I family enzymes including human DNase I that are inhibited by Zn2+55. On the other hand, we speculate that the decrease in the activity at higher Mn2+ concentrations may be caused by significant binding of Mn2+ to the DNA substrate, interfering with the enzyme's recognition/interaction. Concentrations of Zn2+ in saliva are in the order of 0.2–1.2 μM, whereas Ca2+ is present at approximately 0.5–2.75 mM and Mg2+ at 7–30 μM56. These concentrations would potentially support activity of SsnA in oral biofilms./p>

Блог

Межвидовая конкуренция в биопленках полости рта, опосредованная внеклеточной дезоксирибонуклеазой SsnA Streptococcus gordonii